Матричний синтез ДНК
Як вiдомо, генетична iнформацiя записана в ланцюзi ДНК у виглядi
послiдовностi нуклеотидних залишкiв, що мiстять одне iз чотирьох
гетероциклических пiдстав: аденин (A), гуанiн (G), цитозин (C) i тимин
(T). Запропонована Дж. Уотсоном i Ф. Лементом в 1953 роцi модель будови
ДНК у формi регулярноï подвiйноï спiралi вiдразу ж дозволила
зрозумiти принцип подвоєння ДНК. Iнформацiйний змiст обох ланцюгiв
ДНК iдентично, тому що кожна з них мiстить послiдовнiсть нуклеотидов,
строго вiдповiдноï послiдовностi iншого ланцюга. Ця вiдповiднiсть
досягається завдяки наявностi водневих зв'язкiв мiж спрямованими
назустрiч один одному пiдставами двох ланцюгiв — попарно G i C або
A i T. Описуючи цю властивiсть подвiйноï спiралi, молекулярнi
бiологи говорять, що ланцюга ДНК комплементарни за рахунок утворення уотсон-
криковских пара G Р C i AР. Оскiльки два ланцюги мають протилежну
спрямованiсть, ïх називають антипаралельними . Легко представити,
що подвоєння ДНК вiдбувається внаслiдок того, що ланцюги
розходяться, а потiм кожний ланцюг служить матрицею, на якiй
збирається комплементарна ïй новий ланцюг ДНК, результатi
утворяться двi дочiрнi, двуспиральние, неотличимие по будовi вiд
батькiвськоï ДНК молекули. Кожна з них складається з одного
ланцюга вихiдноï батькiвськоï молекули ДНК i одного знову
синтезованого ланцюга. Такий механiзм реплiкацiï ДНК, при якому вiд
одного поколiння до iншого передається один iз двох ланцюгiв, що
становлять батькiвську молекулу ДНК, одержав назву напiвконсервативного
й був експериментально доведений в 1958 роцi М. Мезельсоном i Ф. Сталь
Крiм того, ситезу ДНК характернi такi властивостi, як антипаралельнiсть
i униполярность . Кожний ланцюг ДНК має певну орiєнтацiю.
Один кiнець несе гiдроксильну групу (ВIН), приєднану до 3′-
вуглецю в цукрi дезоксирибозе , на iншому кiнцi ланцюга перебуває
залишок фосфорноï кислоти в 5′-положеннi цукру. Два
комплементарнi ланцюги в молекулi ДНК орiєнтованi в протилежних
напрямках — антипаралельно (при паралельнiй орiєнтацiï
навпроти 3′-кiнцi одного ланцюга перебував би 3′-кiнець
iншоï). Ферменти, що синтезують новi нитки ДНК, називанi Днк-
полимеразами, можуть пересуватися уздовж матричних ланцюгiв лише в
одному напрямку — вiд ïх 3′-кiнцiв до 5′-кiнцiв .
р i цьому синтез комплементарних ниток завжди ведеться в 5′
3′ напрямку, тобто униполярно . Тому в процесi реплiкацiï
одночасний синтез нових ланцюгiв iде антипаралельно .
Днк-полимерази можуть давати “заднiй хiд”, тобто рухатися в
напрямку 3′ 5′. У тому випадку, коли останнє додане
при синтезi нуклеотидное ланка виявилася некомплементарним нуклеотиду
матричного ланцюга, воно буде замiщено комплементарним нуклеотидом.
Отщепив “неправильний” нуклеотид, Днк-полимераза
продовжує синтез в 5′ 3′ напрямку. Така здатнiсть до
виправлення помилок одержала назву коректорськоï функцiï
ферменту (див. нижче).
Днк-полимерази
В 1957 роцi А. Корнберг виявив у кишковоï палички фермент,
катализирующий процес полiмеризацiï ДНК iз нуклеотидов; вiн був
названий Днк-полимеразой. Потiм Днк-полимерази виявили й в iнших
органiзмах. Було показано, що субстратами всiх цих ферментiв служать
дезоксирибонуклеозидтрифосфати ( днтф ), полимеризующиеся на
одноцепочечной Днк-матрицi. Днк-полимерази послiдовно нарощують
одноцепочечную ланцюг ДНК, крок за кроком приєднуючи до неï
наступнi ланки в напрямку вiд 5-5-' до 3′-кiнцю, причому вибiр
чергового днтф диктується матрицею. Приєднання кожного
нового нуклеотидного залишку до 3′-кiнцю зростаючого ланцюга
супроводжується гiдролiзом багатою енергiєю зв'язку мiж
першими й другим фосфатними залишками в днтф i вiдщiпленням пирофосфата
, що робить реакцiю в цiлому енергетично вигiдноï
У клiтках звичайно присутня кiлька типiв Днк-полимераз, що виконують
рiзнi функцiï й мають рiзну будову: вони можуть бути побудованi з
рiзноï кiлькостi бiлкових ланцюгiв (субъединиц), вiд
однiєï до десяткiв. Однак всi вони працюють на будь-яких
послiдовностях нуклеотидов матрицi; завдання цих ферменто в-в- зробити
точну копiю кожноï матрицi
Точнiсть синтезу ДНК i механiзм корекцiï Генетичний матерiал живих
органiзмiв має величезнi розмiри й реплицируется з високою
точнiстю. У середньому в процесi вiдтворення генома ссавця, що
складає iз ДНК довжиною 3 млрд пар нуклеотидов, виникає не
бiльше трьох помилок. При цьому ДНК синтезується надзвичайно
швидко (швидкiсть ïï полiмеризацiï коливається в
межах вiд 500 нуклеотидов/з у бактерiй до 50 нуклеотидов/ з у ссавцiв).
Висока точнiсть реплiкацiï, поряд з ïï високою швидкiстю,
забезпечується наявнiстю спецiальних механiзмiв, що здiйснюють
корекцiю, тобто помилки, що усуває. Суть механiзму корекцiï
полягає в тiм, що Днк-полимерази двiчi перевiряють вiдповiднiсть
кожного нуклеотида матрицi: один раз перед включенням його до складу
зростаючого ланцюга й другий раз перед тим, як включити наступний
нуклеотид. Чергова фосфодиефирная зв'язок синтезується лише в тому
випадку, якщо останнiй (3′-кiнцевий) нуклеотид зростаючого ланцюга
ДНК утворив правильну уотсон-криковскую пари з вiдповiдноï
нуклеотидом матрицi. Якщо ж на попереднiй стадiï реакцiï
вiдбулося помилкове спарювання пiдстав, то подальша полiмеризацiя
зупиняється доти, поки помилка не буде виправлена. Для цього
фермент перемiщається у зворотному напрямку й вирiзує
останню додану ланку, пiсля чого його мiсце може зайняти правильний
нуклеотидпредшественник . Iншими словами, багато хто (але не все) Днк-
полимерази володiють, крiм 5′-3′-синтетичнi активностi, ще й
3′-гидролизующей активнiстю, що забезпечує видалення
помилково спарених з матрицею нуклеотидов.
Основнi принципи реплiкацiï
Основнi правила, вiдповiдно до яких вiдбувається реплiкацiя, були
з'ясованi в досвiдах з бактерiями, однак вони справедливi також i для
вищих органiзмiв
Iнiцiацiя ланцюгiв ДНК
Днк-полимерази не можуть починати синтезу ДНК на матрицi, а здатнi
тiльки додавати новi дезоксирибонуклеотидние ланки до 3′-кiнцю вже
наявноï полинуклеотидной ланцюга. Таку заздалегiдь утворений
ланцюг, до якоï додаються нуклеотиди, називають запалом . Коротку
РНК- запал синтезує з рибонуклеозидтрифосфатов фермент, що не
володiє коригувальною активнiстю й називаний Днк-праймазой ( вiд
англ. primer — запал). Праймазная активнiсть може належати або
окремому ферменту, або однiєï iз субъединиц Днк-полимерази.
Запал , синтезований цим неточним ферментом, що не вмiє виправляти
помилки, вiдрiзняється вiд iншого новосинтезованого ланцюга ДНК,
оскiльки складається з рибонуклеотидов , i далi може бути вилучена
Розмiр рибонуклеотидной запалу невеликий (менш 20 нуклеотидов) у
порiвняннi з розмiром ланцюга ДНК, утвореноï Днк-полимеразой.
Виполнившая свою функцiю Рнк-Запал вiддаляється спецiальним
ферментом, а утворена при цьому пролом зашпаровується Днк-
полимеразой, що використовує як запал 3′- Вiн-Кiнець
сусiднього фрагмента Оказаки (див нижче). Видалення крайнiх Рнк-
Праймеров , комплементарних 3′-кiнцям обох ланцюгiв лiнiйноï
материнськоï молекули ДНК, приводить до того, що дочiрнi ланцюги
виявляються коротше на 10-20 нуклеотидов (у рiзних видiв розмiр Рнк-
Запалiв рiзний). У цьому полягає так звана “проблема
недореплiкацiï кiнцiв лiнiйних молекул”. У випадку
реплiкацiï кiльцевих бактерiальних ДНК цiєï проблеми не
iснує, тому що першi за часом утворення Рнк-Запали вiддаляються
ферментом, що одночасно заповнює пролом, що утвориться, шляхом
нарощування 3′- Вiн-Кiнця зростаючого ланцюга ДНК,
спрямованоï в “хвiст” що видаляється праймеру .
Проблема недореплiкацiï 3′-кiнцiв лiнiйних молекул ДНК
вирiшується еукариотическими клiтками за допомогою спецiального
ферменту — теломерази .
Робота теломерази
В 1985 роцi вiн був виявлений у равноресничной iнфузорiï
Tetrahymena thermophila , а згодом — у дрiжджах, рослинах i
тваринах, у тому числi в яєчниках людини й иммортализованни х (
безсмертних) лiнiях ракових клiток HeLa . Теломераза є Днк-
полимеразой, що добудовує 3′-кiнцi лiнiйних молекул ДНК
хромосом короткими ( 6-8 нуклеотидов) повторюваними послiдовностями (у
хребетних TTAGGG). Вiдповiдно до номенклатури, цей фермент називають ДН
До-К- уклеотидилекзотрансферазой або теломерной термiнального
трансферазой . Крiм бiлковоï частини теломераза мiстить РНК, що
виконує роль матрицi для нарощування ДНК повторами. Довжина
теломеразной РНК коливається вiд 150 нуклеотидов у найпростiших до
1400 нуклеотидов у дрiжджiв, у людини — 450 нуклеотидов. Сам факт
наявностi в молекулi РНК послiдовностi, по якiй iде матричний синтез
шматка ДНК, дозволяє вiднести теломеразу до своєрiдноï
зворотного транскриптазе, тобто ферменту, здатному вести синтез ДНК по
матрицi РНК.
У результатi того що пiсля кожноï реплiкацiï дочiрнi ланцюги
ДНК виявляються коротше материнських на розмiр першого Рнк-Праймера (10-
20 нуклеотидов), утворяться виступаючi однонитевие 3′-кiнцi
материнських ланцюгiв. Вони-Те й упiзнаються теломеразой , що послiдовно
нарощує материнськi ланцюги (у людини на сотнi повторiв),
використовуючи 3′- Вiн-Кiнцi ïх як запали, а РНК, що входить
до складу ферменту, як матриця. Образующиеся довгi одноцепочечние кiнцi,
у свою чергу, служать матрицями для синтезу дочiрнiх ланцюгiв по
традицiйному репликативному механiзму
Поступове вкорочення ДНК хромосом пiд час реплiкацiï є
однiєï з теорiй “старiння” клiтинних колонiй. Ще
в 1971 роцi вiтчизняний учений А.М. Оловников у своïй теорiï
маргинотомии (вiд лат. marginalis -крайовий, tome — перетин)
припустив, що це явище лежить в основi обмеженого потенцiалу
подвоєння, спостережуваного в нормальних соматичних клiток, що
ростуть у культурi in vitro , так званого “лiмiту Хейфлика
“. Американський учений Леонард Хейфлик на початку 60-х рокiв
показав, що якщо для культивування взяти клiтки новонароджених дiтей, то
вони можуть пройти 80-90 розподiлiв, у той час як соматичнi клiтки вiд
70-лiтнiх дiляться тiльки 20- 30 разiв. Обмеження на число клiтинних
розподiлiв i називають лiмiтом Хейфлика .
Розплiтання подвiйноï спiралi ДНК
Оскiльки синтез ДНК вiдбувається на одноцепочечной матрицi, йому
повинне передувати обов'язковий подiл (хоча б на час) двох ланцюгiв ДНК.
Дослiдження, проведенi на початку 60-х рокiв на реплицирующихся
хромосомах, виявили особливу, чiтко обмежену область реплiкацiï, що
перемiщається уздовж батькiвськоï спiралi ДНК i
характеризующуюся мiсцевою розбiжнiстю двох ïï ланцюгiв. Ця
активна область через своєï Y-Образноï форми була
названа репликационной вилкою. Саме в нiй Днк-полимерази синтезують
дочiрнi молекули ДНК. За допомогою електронноï мiкроскопiï
реплицирующейся ДНК удалосьустановить , що область, що уже
реплицирована, має вигляд вiчка усерединi нереплицировавшейся ДНК.
Важливо вiдзначити, що репликационний вiчок утвориться тiльки в тих
мiсцях молекули, де перебувають специфiчнi нуклеотидние послiдовностi.
Цi послiдовностi, що одержали назву крапок початку реплiкацiï,
складаються приблизно з 300 нуклеотидов. Залежно вiд того, в одному або
у двох напрямках вiдбувається реплiкацiя (а це залежить вiд
природи органiзму), вiчко мiстить одну або два репликационние качани.
Послiдовний рух репликационной качани приводить до розширення вiчка
Подвiйна спiраль ДНК досить стабiльна; для того щоб вона розкрилася,
необхiднi особливi бiлки. Спецiальнi ферменти Днк-хеликази швидко
рухаються по одиночному ланцюзi ДНК, використовуючи для перемiщення
енергiю гiдролiзу AT Ф. Зустрiчаючи на шляху дiлянка подвiйноï
спiралi, вони розривають водневi зв'язки мiж пiдставами, роздiляють
ланцюга й просувають репликационную вилку. Слiдом за цим з одиночними
ланцюгами ДНК зв'язуються спецiальнi дестабiлiзуючу спiраль бiлки, якi
не дозволяють одиночним ланцюгам ДНК зiмкнутися. При цьому вони не
закривають пiдстав ДНК, залишаючи ïх доступними для спарювання Не
слiд забувати, що комплементарнi ланцюги ДНК закрученi друг навколо
друга в спiраль. Отже, для того щоб репликационная вилка могла
просуватися вперед, вся ще не подвоєна частина ДНК повинна була б
дуже швидко обертатися. Ця топологiчна проблема вирiшується шляхом
утворення в спiралi свого роду “шарнiрiв”, що дозволяють
ланцюгам ДНК розкрутитися. Приналежнi до особливого класу бiлки,
називанi Днк-топоизомеразами , вносять у ланцюг ДНК одноабо
двухцепочечние розриви, що дозволяють ланцюгам ДНК роздiлитися, а потiм
зашпаровують цi розриви. Топоизомерази беруть участь також у
розчiплюваннi зачеплених двухцепочечних кiлець, що утворяться при
реплiкацiï кiльцевих двунитевих ДНК. За допомогою цих важливих
ферментiв подвiйна спiраль ДНК у клiтцi може приймати ”
недокручену ” форму з меншим числом виткiв; у такий ДНК легше
вiдбувається розбiжнiсть двох ланцюгiв ДНК у репликационной вилцi
Переривчастий синтез ДНК
Легко уявити, що реплiкацiя вiдбувається шляхом безперервного
росту нуклеотида за нуклеотидом обох нових ланцюгiв у мiру перемiщення
репликационной качани; при цьому, оскiльки два ланцюги в спiралi ДНК
антипаралельнi , один з дочiрнiх ланцюгiв повинна була б рости в
напрямку 5′-3′, а iнша в напрямку 3′-5′. У
дiйсностi, однак, виявилося, що дочiрнi ланцюги ростуть тiльки в
напрямку 5′-3′, тобто завжди подовжується 3′-
кiнець запалу , а матриця зчитується Днк-полимеразой у напрямку
3′-5′. Це твердження на перший погляд здається
несумiсним з рухом репликационной качани в одному напрямку, що
супроводжується одночасним зчитуванням двох антипаралельних ниток.
Розгадка секрету полягає в тiм, що синтез ДНК вiдбувається
безупинно тiльки на однiй з матричноï ланцюгiв. На другому
матричному ланцюзi ДНК синтезується порiвняно короткими
фрагментами (довжиною вiд 100до 1000 нуклеотидов, залежно вiд виду),
названими по iм'ю ïхнього вченого, що виявив, фрагментами Оказаки
). Знову утворений ланцюг, що синтезується безупинно,
називається провiдноï, а iнша, що збирається iз
фрагментiв Оказаки , що вiдстає. Синтез кожного iз цих фрагментiв
починається iз Рнк-Запалу . Через якийсь час Рнк-Запали
вiддаляються, пролому забудовуються Днк-полимеразой i фрагменти
зшиваються в один безперервний ланцюг ДНК спецiальним ферментом
Кооперативна дiя бiлкiв репликационной качани
Дотепер ми говорили про участь окремих бiлкiв у реплiкацiï так,
начебто б вони працюють незалежно друг вiд друга. Тим часом у дiйсностi
бiльша частина цих бiлкiв об'єднана у великий комплекс, що швидко
рухається уздовж ДНК i узгоджено здiйснює процес
реплiкацiï з високою точнiстю. Цей комплекс порiвнюють iз
малюсiнькою “швейною машиною” : “деталями” його
служать окремi бiлки, а джерелом енергiï — реакцiя гiдролiзу
нуклеозидтрифос фатiв. Спiраль розплiтається Днк-хеликазой ; цьому
процесу допомагають ДН До-К- топоизомераза , що розкручує ланцюга
ДНК, i безлiч молекул дестабiлiзуючого бiлка, що зв'язуються з обома
одиночними ланцюгами ДНК. В областi вилки дiють двi Днк-полимерази
— на провiдному й вiдстаючому ланцюзi. На провiдному ланцюзi Днк-
полимераза працює безупинно, а на вiдстаючий фермент час вiд часу
перериває й знову вiдновляє свою роботу, використовуючи
короткi Рнк-Запалу , синтезованi Днк-праймазой . Молекула Днк-праймази
безпосередньо пов'язана iз Днк-хеликазой , образуя структуру, називану
праймосомой . Праймосома рухається в напрямку розкриття
репликационной качани й по ходу руху синтезує Рнк-Запал для
фрагментiв Оказаки . У цьому ж напрямку рухається Днк-полимераза
провiдного ланцюга й, хоча на перший погляд це важко представити, Днк-
полимераза вiдстаючого ланцюга. Для цього, як думають, последня
накладає ланцюг ДНК, що служить ïй матрицею, саму на себе, що
й забезпечує розворот Днк-полимерази вiдстаючого ланцюга на 180
градусiв. Погоджений рух двох Днк-полимераз забезпечує
координовану реплiкацiю обох ниток. Таким чином, у репликационной вилцi
одночасно працюють бiля двадцяти рiзних бiлкiв (з яких ми назвали тiльки
частину), здiйснюючи складний, високоупорядоченний i енергоємний
процес
Погодженiсть процесiв реплiкацiï ДНК i клоеточного розподiлу
еукариотическая клiтка перед кожним розподiлом повинна синтезувати
копiï всiх своïх хромосом. Реплiкацiя ДНК еукариотической
хромосоми здiйснюється за допомогою разделени хромосоми на безлiч
окремих репликонов . Такi репликони активуються не все одновременно,
однак клiтинному розподiлу повинна передувати обов'язкова однократна
реплiкацiя кожного з них. Зi сказаного ясно, що по хромосомi еукариот у
кожний момент часу може рухатися незалежно друг вiд друга безлiч
репликационних качан. Зупинка просування качани вiдбувається
тiльки при зiткненнi з iншою вилкою, що рухається в протилежному
напрямку, або по досягненнi кiнця хромосоми. У результатi вся ДНК
хромосо ми в короткий строк виявляється реплицированной. Пiсля
складання на молекулi ДНК хромосомних бiлкiв кожна пара хромосом у
процесi мiтозу упорядоченно роздiляється по дочiрнiх клiтках
Висновки
Процес реплiкацiï ДНК погоджений iз клiтинним розподiлом i
требуетсовместного дiï багатьох бiлкiв. У ньому беруть участь:
1. Днк-хеликаза й дестабiлiзуючi бiлки; вони розплiтають подвiйну
спiраль батькiвськоï ДНК i формують репликационную качану
2. Днк-полимерази, якi катализируют синтез полинуклеотидной ланцюга ДНК
у напрямку 3′-5, копiюючи в репликационной вилцi матрицю з
високим ступенем точностi. Оскiльки два ланцюги подвiйноï
спiралi ДНК антипаралельнi , у напрямку 5′-3′ безупинно
синтезується лише один iз двох ланцюгiв, що веде; iнший ланцюг,
отстающа , синтезується у виглядi коротких фрагментiв Оказаки .
Днк-полимераза здатна до виправлення власних помилок, але не може
самостiйно почати синтез нового ланцюга
3. Днк-праймаза , що катализирует короткi молекули Рнк-Запалу . Згодом
фрагменти РНК вiддаляються — ïх замiняє ДНК.
4.Теломераза, що закiнчує побудову недорепликацированих 3′-
кiнцiв лiнiйних молекул ДНК.
4. Днк-топоизомерази , що допомагають вирiшити проблеми крутiння й
сплутування спирали ДНК.
5. Инициаторние бiлки, що зв'язуються в крапцi початки реплiкацiï й
сприятливому утворенню нового репликационного вiчка з
однiєï або двома качанами. У кожнiй з вилок слiдом за
инициаторними бiлками до розплетеного ДНК спочатку
приєднується бiлковий комплекс, що складається iз
Днк-хеликази й Днк-праймази ( праймосома ).
Потiм до праймосоме додаються iншi бiлки й виникає
“репликационная машина”, що i здiйснює синтез ДНК.
Лiтература
6. О. О. Фаворова . Збереження ДНК у рядi популяцiй: реплiкацiя ДНК.
Соросовский освiтнiй журнал, 1996 р.
7. Г.М. Димшиц. Проблема раепликации кiнцiв лiнiйних молекул i
теломераза . Соросовский освiтнiй журнал, 2000 р.
